12月23日，貴州大學(xué)綠色農(nóng)藥全國(guó)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室博士生王艷菊在Aggregate(影響因子IF=13.9)期刊發(fā)表了題為“A Vanillin‐Derived Inhibitor of Aggregates via Targeting Intrinsically Disordered Regions of Phytoviral Nucleocapsid Protein”的研究論文，揭示了香草醛衍生物29通過結(jié)合番茄斑萎病毒核衣殼蛋白(TSWV NP)直接干擾相分離(PS)發(fā)生，抑制凝聚體而降低其致病性的機(jī)制。

　　番茄斑萎病毒(Tomato spotted wilt virus，TSWV)是一種三分體負(fù)義鏈RNA病毒,被認(rèn)為是最具毀滅性的植物病毒之一。目前，用于防治TSWV的化學(xué)藥劑可用抗病毒劑種類較少，且對(duì)不同病毒之間的防效差異較大。因此，發(fā)掘新型高效且作用機(jī)制獨(dú)特的抗TSWV小分子對(duì)保障糧食安全具有重要意義。

　　相分離(PS)已成為各種病毒生命周期中的重要機(jī)制，在許多情況下，PS促進(jìn)宿主細(xì)胞內(nèi)無膜細(xì)胞器或生物分子聚集體的形成，這些細(xì)胞器可以作為病毒復(fù)制、轉(zhuǎn)錄和組裝的樞紐。TSWV復(fù)制主要依賴于核糖核蛋白復(fù)合物(RNP)，其可以被認(rèn)為是一種聚集體，它們的形成對(duì)于病毒的生命周期至關(guān)重要。因此，破壞RNP的形成或抑制TSWV復(fù)制并控制植物病害。鑒于RNPs的形成可能涉及TSWV NP的PS，如果能發(fā)現(xiàn)阻礙PS發(fā)生的抑制劑去干擾凝聚體RNP的形成，則有望控制TSWV在植物體內(nèi)的增殖。目前在農(nóng)業(yè)領(lǐng)域仍未見任何涉及小分子直接干擾PS發(fā)生并抑制凝聚體形成的報(bào)道。

圖1 化合物29抑制TSWV增殖的可能作用機(jī)制模式圖

　　作者通過簡(jiǎn)潔高效的5步取代反應(yīng)合成了一系列香草醛衍生物，并通過半葉枯斑法測(cè)試了所有目標(biāo)化合物的抗TSWV活性，其中，化合物29抗TSWV的鈍化活性EC??為154.8μg/mL，優(yōu)于商品藥劑利巴韋林ribavirin(701.9 μg/mL)，表明化合物29可能作為一種潛在的抗TSWV小分子。化合物29與TSWV NP的分子對(duì)接表明，TSWV NP^K68、TSWV NP^T92和TSWV NP^R94可能是化合物29作用于TSWV NP的潛在靶標(biāo)位點(diǎn)。作者通過原核誘導(dǎo)表達(dá)純化了野生型TSWV NP和突變型TSWV NP，通過生物膜層干涉分析測(cè)試了化合物29與兩種蛋白的結(jié)合力，體外驗(yàn)證氨基酸位點(diǎn)作為潛在靶點(diǎn)的可能性。此外，通過同源重組法構(gòu)建了突變的侵染性克隆TSWV^K68A、TSWV^T92A、TSWV^R94A、TSWV^K68AT92AR94A和TSWV^K68GT92GR94G，體內(nèi)驗(yàn)證氨基酸位點(diǎn)作為潛在靶點(diǎn)的可能性。結(jié)果表明，單個(gè)氨基酸位點(diǎn)的突變對(duì)TSWV的侵染有一定的影響，但是只有三個(gè)氨基酸位點(diǎn)同時(shí)突變?yōu)楸彼?TSWV^K68AT92AR94A)時(shí)對(duì)TSWV的侵染影響更大。

　　以前的研究已經(jīng)表明TSWV的侵染與寄主蛋白之間的密切聯(lián)系，為了探索與TSWV NP相互作用的潛在寄主蛋白，作者采用了免疫沉淀與質(zhì)譜聯(lián)用，并通過Y2H、BiFC和LCA驗(yàn)證TSWV NP與寄主蛋白的互作，發(fā)現(xiàn)一種寄主蛋白GTP結(jié)合核蛋白(NbRANL)能夠與TSWV NP相互作用(圖2)。通過轉(zhuǎn)錄組學(xué)、瞬時(shí)過表達(dá)和Craspr-cas9基因敲除等驗(yàn)證表明NbRANL在TSWV的侵染中起著正向調(diào)控的作用。此外，作者還發(fā)現(xiàn)NP能夠在體內(nèi)通過相分離形成凝聚體(圖3)，同時(shí)NbRANL能夠促進(jìn)TSWV NP凝聚體的形成。

圖2 Y2H、BiFC和LCA驗(yàn)證TSWV NP和NP^K68AT92AR94A與NbRANL的相互作用。

圖3 PS誘導(dǎo)NP凝聚體的形成

　　綜上，該研究表明香草醛衍生物29通過結(jié)合TSWV NP的氨基酸位點(diǎn)，影響NP發(fā)生相分離形成凝聚體，同時(shí)發(fā)現(xiàn)寄主互作因子NbRANL能夠促進(jìn)NP形成凝聚體，為TSWV抗病毒藥劑的發(fā)現(xiàn)及作用機(jī)制研究奠定了基礎(chǔ)。此工作部分結(jié)果近期發(fā)表于Aggregate上(https://doi.org/10.1002/agt2.725)。貴州大學(xué)綠色農(nóng)藥全國(guó)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室2019級(jí)農(nóng)藥學(xué)專業(yè)博士生王艷菊為論文第一作者，宋寶安、宋潤(rùn)江和俞露為該論文共同通訊作者。本研究得到國(guó)家自然科學(xué)基金(32330087，32302388)和科技攻關(guān)計(jì)劃資助貴州省科研創(chuàng)新團(tuán)隊(duì)項(xiàng)目(2017-5788-1)和貴州大學(xué)科研創(chuàng)新團(tuán)隊(duì)項(xiàng)目(202403)的支持。